二维薄层色谱应当满足两个条件：
1）两个维度的分离机制是相互正交的；
2）在第一维中已被分离开的两个物质在第二维展开的过程中依然是分离的。2D-TLC在扩充峰容量提高分离效果的基础上，几乎保留了一维色谱的所有优点：采用一次性固定相，样品通常无需净化精制，节约分析成本和时问；结果可视化；所需展开剂量少，节约试剂；固定相和流动相选择范围广；所有斑点贮存在薄层板上，可随时对其重复扫描检测，得出最佳结果。二维2D-TLC最常用的模式有两种：1）单固定相二维薄层色谱
单固定相二维薄层色谱 (2D—TLC on one absorbent)，即薄层板只有一种固定相涂层。样品在薄层板的一角点状点样，在第一个方向上展开， 晾干之后，旋转90。，在第二个方向上再次展开。为达到较好的分离效果，一般可选择中等极性的固定相，并在两个方向上使用不同的溶剂系统，使两个维度分别为正相展开系统和反相展开系统。当然，理论上也可以在两个维度上都使用相同的展开系统，但这样只是相当于延长了展距，对分离效果并无明显的提升，因此较少被采用。
这里存在着一个问题，由于两次展开都在同一块薄层板上进行，因此第一维所使用的展开剂很可能会对固定相的性质造成一定的影响，为了避免这种情况的发生，在两次展开之间的流动相去除步骤十分关键。倘若第一维展开剂中含水，则干燥过程将十分耗时，且很难控制薄层板的含水量，故建议将含水展开剂放在第二维，以确保方法的重现性。
以百里香油的TLC为例，1D-TLC分离效果：
流动相：甲苯和乙酸乙酯（97.5：2.5v / v）。（a）茴香醛 - 硫酸试剂和（b）乙醇-香草醛。
百里香油2D-TLC分离效果：
Thymi Oleum化合物的2D-TLC分离
2） 双固定相二维薄层色谱
双固定相二维薄层色谱 (2D—TLC on bilayer plates)，即薄层板铺有两种不同的固定相涂层，一种涂层为一窄条带，薄层板的剩余空间铺满另一种涂层。样品在条带涂层的一端点状点样，在第一个方向上展开，晾干之后，旋转90。在第二种涂层上进行展开。第一维固定相还能起到预浓缩的作用，使第二维展开的条带更细，展开结果更为美观。
双固定相二维色谱也和单固定相二维色谱存在着相同的问题，即两次展开过程之问的干燥问题，但其问题更为严峻，单固定相二维色谱尚可选择将反相系统在第二维展开，但双固定相二维色谱的两个维度已被预制，第一维若为十二烷基硅胶之类的固定相，则只能选择将反相展开系统作为第一维，无法回避控制含水量的问题。
除了分离，2D- TLC还可以用来确定化合物在二氧化硅上是否稳定。2D- TL常规使用步骤如下：
1. 将TLC板切成方形。良好的尺寸是7厘米x 7厘米，但请确保它首先适合您的溶剂容器
2. 将用于色谱柱的溶剂倒入玻璃容器中。溶剂应该是2-3毫米深，这样斑点样品不会浸没。这确保了样品不会溶解到溶剂中并随着溶剂向上移动到TLC板上。
3. 使用毛细管将样品“点”到左下角的板上（a）。该点应距离底部和左侧边缘约0.5-1厘米，直径1-2毫米。
3. 将TLC板放在容器中。不要移动或打扰板或TLC容器，因为这会导致溶剂中的波纹和溶剂的不规则。当溶剂前端距离板顶部0.5-1 cm时，用镊子小心地从容器中取出板。
4. 让溶剂蒸发。将板旋转90°，使原始样品点位于右下角。组分斑点将沿着板的底部形成水平线（c）。
5. 将TLC板放回容器中。当溶剂前端距离板顶部0.5-1 cm时，用镊子小心地从容器中取出板。
6. 让板上的溶剂蒸发，然后使用UV灯或高锰酸钾浸渍使板可视化。
7. 用铅笔标记所有斑点的位置。从样品被点样的角落，通过样品点，到对面的角落画一条对角线。在二氧化硅上稳定的化合物将出现在对角线上。如果化合物在二氧化硅上分解，其斑点将低于对角线。
如果您发现您的化合物在二氧化硅上不稳定，请考虑使用氧化铝或其他纯化技术，如结晶或蒸馏。也可以推迟纯化化合物并将整个样品带到序列中的下一步。根据下一步反应，您的化合物可能会转化为对二氧化硅更稳定且更易于净化的物质。
