薄层色谱是化学的一种分离和分析方法，也是现代有机合成、高分子材料分离与解析的重要方法。结合柱分离的薄层色谱技术能够具有充分的实战意义。

薄层色谱是一种微量分析的分离过程，它将样品点在以玻璃板或铝、塑料等片材为载体的多孔吸附剂薄层的固定相上,利用流动相在特定的展开室中将混合物中的组份推移到不同距离处，在色谱展开整个过程中，样品的成份受到正反不同的力的作用。

1、 流动相利用毛细管力带着样品穿过固定相；

2、样品与固定相的相互作用是指组份在移行过程中由于偶极 -（诱导） - 偶极相互作用，氢键和范德华力的作用而产生不同程度的延缓、吸附、分散、离子交换和络合等分离机理。

由于样品组份与流动相和固定相之间的相互作用力程度不同，整个毛细管流动过程中分离运动都在进行。基于这点，TLC系统（流动相和固定相）必须与样品很好地匹配。

用显色试剂处理，许多组份可在日光或紫外灯光下检视。色谱可用肉眼或使用光密度计和照相机记录或影像系统方法来评价。

薄层色谱使用的设备：薄层板

1、手工自制板

1）、玻璃板的要求：用于制备薄层板的玻璃板要求表面光洁、平整，最好使用厚薄1~2mm的优质平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄层板，玻璃板需洗净至不挂水，晾干，贮存于干燥洁净处备用。玻璃板反复使用时，应注意经常用洗液及碱液清洗，保持玻璃板面的光洁是保证薄层板质量的最基本要求。

2）、制作方法:除另有规定外，将1份吸附剂加适量的水（如1份硅胶G一般加3份水），在研钵中用研杵沿一个方向小心研磨至成均匀的有适当粘稠度的胶浆,立即倾入涂布器中,均匀地向前推进涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的规定操作涂布;涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干,再在规定的温度(一般为105℃~110℃)下烘约30分钟活化,贮于干燥器中备用。薄层板的厚度一般为0.25~0.5mm.。

2、商品化供应的预制板和高效板

1）、板的尺寸   
        20x20cm           10x20cm         20x10cm          10x10cm

TLC/HPTLC预制板有不同的规格供应。常用的尺寸为20 x 20，10 x 20，20 x 10，或10x 10 cm。使用的规格取决于TLC或HPTLC的类别和样品的数目。

3、 TLC/HPTLC板的预洗及活化

一般来说，色谱板应用溶剂如氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更强的洗脱溶剂的混合物进行预洗。具体操作可通过空白色谱展开来实现。色谱板预洗完后,应在105?C加热1小时进行干燥，再在室温下置放至少2小时（需采取保护措施以防止实验室空气中的污染物重新附着在其上面，如放置在空的干燥器中）。

薄层色谱操作

1、点样：除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为2-4mm，点间距离约为1.5-2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。

2、 展开：展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为10—15cm），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测，如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。

薄层层析操作关键点

1、铺板

铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1：2～3，硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间，根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。

2、点样

尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。

3、展开剂配制

选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移液管应符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。

5、展开系统的饱和

一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和，防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。 

6、温湿度的控制

温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离，例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿度应根据实际情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫酸。

7、显色

喷显色剂显色最重要是有好的雾化器。

薄层色谱关键问题解读

1、怎样提高点样效率？

点样是造成TLC定量误差的主要来源。实验证明：定量毛细管更适合较小体积的点样；微量注射器更适合较大体积的点样。这主要是因为微量注射器受小气泡、溶液回爬现象的影响较大。为避免不同定量毛细管理体制的占样误差，建议一块薄层板上最好用同一只定量毛细管。但应注意更换样品时，应将毛细管用超声波或不同极性溶课剂清洗干净。在制备样品时，溶样溶剂黏度不能过高，以便于点样；溶剂沸点过低则进样体积易变，过高则会改变展开剂组成；对样品溶解度过高会使样点发生空心现象，常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮。经典TLC样点原点一般为直径3mm点间距离1-2cm底边距离1.5cm；HPLC样点原点一般为直径1mm点间距5mm底边距1cm。

2、展开剂的选择

TLC与HPLC相比，一个突出的优点就是流动相的选择具有更大的灵活性，流动相的选择的目的是使绝大部分样品的Rf值位于0.1－0.7之间并达到较好的分离，与此对应的是流动相要有适当的强度和组成。流动相强度越大，溶质Rf值越大，但很可能降低分离能力；另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物、根据相似相溶原理，要使用多元溶剂体系。一般展开剂体系选择如下：根据分离样品性质、薄层色谱板性质选择一个二元溶剂体系，通过调节溶剂比例以寻求适合Rf值，适合的Rf值找到后，再寻求极性参数相同的二元溶剂体系两个，以这三个组成为三点组成一个三角形，则可看到：三角形顶点是二元体系，边是三元体系，三角形内是四元体系，并且极性一致，可根据几何原理得出任一点组成，这种方法较为直观，也较简单。

3、TLC的通用显色方法

理想的显色希望灵敏度高，斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好，斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正比，在样品组成并不完全已知的情况下，通用显色方法显得尤为重要，通用显色方法主要有：

1）、紫外照射法：方便、不破坏样品；

2）、碘蒸气法：通用性强，与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用；

3）、荧光试剂：制造荧光背景，使原来紫外下无荧光物质被鉴别，有荧光物质更明显；

4）、硫酸溶剂：对绝大多数有机物有效，但有破坏性。

薄层色谱技术放大--柱分离操作

1、装柱

装柱子（添硅胶）时，常用的有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（称为固定相更为广义）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右（长度没有绝对之说，根据自身情况而定，制备的大柱可以长达一米），太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。

 
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压（土方法可以用养鱼的氧气泵加压或是用氮气，当然不加压也可以）用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。（我一般都用湿法装柱）

干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（一般柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到）（梯度洗脱时，湿法装柱也会出现该情况，比较不好处理，可以缓慢改变溶剂，且置于通风处），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚（用乙醚最最明显），二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：

第一、硅胶一定要压结实；

第二、 一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。  

也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂(我一般垫张滤纸，撒上石英砂，再放些棉花)，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。

2、上样

上样也有干法和湿法之分：

干法（也称硅胶制沙）就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。（我一般喜欢用这种方法，除非不能用）

湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。

湿法较方便，但不溶剂让其完全被硅胶均匀吸附，不容易跑的很平整。

柱层析关键在于柱子是否装好（这是最大影响因素）和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC（作用还是很大的）的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。

上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。（这一点很实用，不过有些特殊情况也不一定，如果要保险可以先做根小柱子跑一下，这样最安全，就是花点时间）

3、收集

主要依靠TLC（据说国外有石英柱，直接用荧光灯照能看出来，不过太贵了，在国内不一定适用），需要切记的是：

 
第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。

第二、点不能点得太浓（在最后时应该点的浓点，这样看看有无收尽产品）,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。 

第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适才能有一个交好的分离效果。 

选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚 展开剂的比例要靠尝试。

一般根据文献（这是首选）中报道的该类化合物用什么样的展开剂，就首先尝试使用该类展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。

很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果。不行可以尝试两两混合，三者混合，一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。 

在利用TLC跟踪反应时，在点板的时候往往是反应体系的混和溶液点一个点A，每种难挥发的原料各点一个点B,C, D等等，然后所有的原料和反应体系的混合溶剂再共同点 一个混合点X，这些点在板上的位置如图所示：A X B C D

这样的好处是展开后可以清楚地看见每个点的位置，把A这个点展开后的各个层份的 点与B,C,等原料比较，从而判断原料消失没有，点混合点X的目的在于，方便观察，因为有时候，板展开后，各点的位置有些变形，或者由于边缘效应等等，使得判断不易。（我喜欢用小板，跑的快，很快见到结果，为了避免小板的边缘，用机器板较好）

利用TLC判断物质的纯度时，如果不能完全确定，可以再结合其他检测手段，如NMR，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。

但有趣的是，由于H-NMR可鉴别 的纯度也就在95%左右，有时候H NMR现示较纯的东西，一点板就会发现有几个点。所以，两者要结合使用。如果有标准品或是以前做过的，对个对照最方便。

根据多年来使用柱层析的操作经验，本文总结了在使用柱层析时的几个技巧：

为了避免浪费硅胶和溶剂，最初学习装柱时最好对实验室中各种不同规格的柱子摸摸底。方法很简单：用量筒量出 100 毫升干硅胶， 直接倒入各种规格的柱子中，敲实，用刻度尺量出硅胶在柱子中的高度，这样就可以做到心中有数了。

一般在装柱的时候可以根据实验所需柱子的高度来调整硅胶的使用量，这样就可以大大地节省硅胶的使用，避免造成没有必要的浪费。称量硅胶时一般称30~70倍于上样量， 如果极难分， 也可以用100 倍量以上的硅胶。

有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好，但过柱层析时还是很难分开。这主要的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多，所以分离效果好。

解决的办法就是降低洗脱剂的极性，一般柱层析用洗脱剂比薄层层析用的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好的分离效果。当所分离物质极性跨度较大时， 可用采梯度洗脱的方法， 即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。

常用的展开剂极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。对于很难分离的化合物，一是增加柱子的长度和直径，二是减小洗脱剂的极性，这样可以很好地将混合物分开。

在同样能洗脱的情况下，尽量使用毒性小的洗脱剂。例如，乙酸乙酯：石油醚系统和二氯甲烷：石油醚系统， 在同样都能洗脱的情况下，应该用毒性小的乙酸乙酯：石油醚系统。

另外洗脱剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。

这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，混合溶剂的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化， 一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适。还有一般回收的溶剂中会有少量水分，使用前先要用干燥剂干燥好才能使用。

用漏斗将活好的固定相倒入柱子中， 打开底部活塞， 将柱子中高出固定相的溶剂放出。期间不断用橡皮棒敲打， 将固定相敲实， 做到密实均匀无气泡即可。

很多时候用加压的方法可以很高效地装好柱子，而且在柱子中没有气泡产生。

干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱子中， 然后用油泵抽柱子底部， 相当于减压过柱， 直到柱子变得很结实， 再用淋洗剂“走柱子” 。

干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后， 由于溶剂和固定相之间的吸附放热， 所以柱子容易变花，影响分离效果。

解决的方法是：

（1）、固定相一定要添加结实；

（2）、一定要用较多的溶剂“走柱子”，直到柱子的下端不再发烫， 恢复到室温后再撤去压力。无论使用哪种方法装柱，最后都要求所装的柱子结实、匀称、无气泡。

在不用海沙的情况下， 尽量不要破坏硅胶面。加样后， 打开柱底活塞， 让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗脱剂，再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。

然后就可以放心地加入大量洗脱剂， 而不会冲坏硅胶表面。很多样品在上柱前是粘乎乎的， 一般没关系。有的时候上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现， 是因为硅胶对样品的吸附饱和， 而样品本身又是比较好的固体才会析出， 这就需要先重结晶样品， 得到大部分的产品后剩余的产品再柱分。

如果不能重结晶也没关系，直接过柱就行， 样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解， 最后随着洗脱剂流出。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如 DMF，DMSO等， 会随着溶剂一起走， 显色是一个很长的脱尾） ， 这时就必须用干法上柱了。

 干法过柱是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶， 拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按 1：1 的量混合， 硅胶使用的量也可以少一些， 但是要保证在旋干后， 不能看到明显的固体颗粒，让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心地加入到装好的柱子中， 加入洗脱剂洗脱。

减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发， 有时会在柱子外面有水汽凝结， 另外有些比较易分解的东西可能得不到， 而且还必须同时使用水泵抽气， 噪音大， 时间长， 所以减压过柱用得比较少。

加压过柱是一种比较好的方法， 与常压柱类似， 但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵 （用鱼缸供气的加压泵就行）。特别是在容易分解的样品的分离中很适用。

一般压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。因为加压过柱效率高， 分离效果较好， 所以加压过柱在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。

一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡， 使柱子变花， 利用加压过柱法在装柱时就可以有效地解决这个问题， 而且可以使柱子很快装实。

薄层色谱应用：

1、定性鉴别

化学上经典的定性鉴别，例如经典的有机定性分析或经典的毒物分析，是利用各种化合物的溶解度不同和所含功能基的不同，用溶剂提取或用试剂处理，把它们分组或分为单一组分，然后作试管反应或点滴反应（颜色反应），或根据它们衍生物的理化性质进行定性鉴别。这种方法的缺点是样品用量较大，分离手续麻烦，分析时间较长（几小时或几十个小时），并可能有杂质干扰，现采用合适的展开剂和显色剂在薄层上作为分离和鉴别，根据样品中组分的值和显色情况，同时用标准作对照，一般即能确证为某一化合物，用薄层色谱法定性，样品用量小，分离方便，分离时间短（几分钟或几十分钟），检出灵敏度高。例如，在毒物分析中检验是否巴比妥安眠药中毒时，取胃内容物或尿样品，先用盐酸酸化后，用乙醚提取，乙醚提取液脱水，过滤蒸干，溶于无水乙醇中，点在硅胶版上用氯仿无水乙醇（36：1）展开，用硫酸汞二苯偶碳酰肼试剂显色，并用标准品对照，依次见出巴比妥，苯巴比妥，戊巴比妥和异巴比妥。鉴别速度快（1小时），这对于抢救中毒患者和及时为医生提供治疗方案极为重要。

2、化合物质量控制与杂志检查

药品的纯度，通常用熔点，吸光值等物理常数作为鉴定的指标。但是薄层检查也是药品质量控制和杂质检查的一种有效方法，有时甚至比一般方法更有效。一些国家的药典和药品规范已经采用。方法是把一定量的样品溶液（例如，相当于样品10%）点在薄层上，用展开剂展开并显色，同时用纯品作对照，如果样品不只显示出纯品位置一致的一个斑点，则表示含有杂质。进一步可用薄层作杂质的限量检查。在上例中，如果已经知道显色剂对杂质的最小检出量为0.1%，在薄层上点样后不显出杂质斑点，则杂质的量低于0.1%，或低于限度，也就是样品的纯度不低于99.9%。例如镏体药物的合成和精致工作中，常含结构类似的杂质，即按上述方法控制其质量和杂质的限量。

3、化学反应进程的控制

反应副产物的检出以及中间体的分析，在化学反应进行到一定时间或反应终了时，把反应液取出作薄层分析，可以知道还剩下多少原料药未起作用。方法是把反应液或其有机溶剂提取液点在薄层上，同时点原料作参比对照，看薄层上是否出现原料药斑点。还可以用薄层检查反应副产物。如果化学反应分步进行，则每一步反应的中间体的质量和产率也都可用薄层进行定性和定量。例如在合成强力霉素的过程中，需要中间体甲烯土霉素氢化物为脱氧土霉素。氢化反应是否完全，可用薄层检查，如果反应完全，则反应釜中几乎没有或只有极少量的甲烯土霉素存在，薄层板上只显示出一个脱氧土霉素，如果薄层板上有上下二个明显的斑点，表示反应还没有完全，尚需继续还原，直到只显示出脱氧土霉素的一个斑点为止才能出料。

4、柱色谱法分离条件的探索

柱色谱法的实验条件，例如选用什么吸附剂和洗脱剂较好，各个组分按什么顺序从柱中洗脱出来，每一分洗脱液中是含单一组分或就含几种没有分开的组分等，都可以在薄层上进行探索和检验。薄层上所有的展开剂虽不完全照搬柱色谱法上，但仍有参考价值。

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