（作者toptip注明：本文是基于个人理解来整理的端粒和端粒酶的发现历史，因为知识时间有限，
其中必有偏差和谬误的地方，关键之处还是以原始文献为主。本人之所以赶这趟诺贝尔奖热，
花大量的时间进行文献阅读和整理，是因为它提供了一次极好的向公众传播科学思想的机会。
由于端粒和端粒酶领域的一系列发现贯穿着“发现现象/问题”-“提出概念/模型”-“实验验证”的思路，
重现这个思路对科学工作者是有启发意义的。本文也提供了一个很好的教学案例。物当尽其用，欢迎转载传播。）

究竟是重组还是全新的酶？为了厘清这两个假说，Liz意识到最重要的是找到这个“酶”。如前所述，
在四膜虫接合细胞的大核发育过程中，大核产生了非常丰富的染色体，每一个小染色体都被从头加上了端粒。
可以推测，如果“酶”的假说成立，此时细胞内的“酶”活性应该是非常高的。1984年，Carol女士作为博士生加盟了Liz实验室。
她们俩精心讨论设计实验，用四膜虫的核抽提液与体外的端粒DNA进行温育，试图在体外检测到这个“酶”活性，
看到端粒的延伸。经过不断优化条件，尤其是把底物换成体外合成的高浓度的端粒DNA后，同年的圣诞节，
勤奋的Carol同学打开暗盒曝光x光片，终于清楚地看到了“酶“活性。在测序胶的同位素曝光片上，
端粒底物明显被从新加上了DNA碱基，而且每六个碱基形成一条很深的带，与四膜虫端粒重复基本单位为六个碱基正好吻合[8]。
这种酶活性不依赖于模板，只对四膜虫和酵母的端粒DNA进行延伸，而对随机序列的DNA底物不延伸；
并且该活性不依赖于DNA聚合酶[8]。由于同源重组对序列没有特异性的要求并且依赖于DNA聚合酶的活性，
至此，她们澄清了这两种假说，证明了有一种“酶”来延伸端粒DNA。这种酶后来被命名为“端粒酶”（telomerase）。

端粒酶RNA亚基的发现

紧接着她们对端粒酶活性进一步定性。此时Tom Cech（因为发现RNA可以有酶活性获得诺奖）正好访问Liz的实验室，
她/他们一起做了个简单的实验，就是用RNA酶处理样品，降解样品的RNA，看看端粒酶活性是否受到影响。
结果是酶活性竟然消失了，端粒酶活性依赖于RNA[9, 10] 。端粒酶会不会是另外一种特殊的RNA酶？
想必从这个时候，Tom Cech 开始被端粒酶深深吸引，并介入了这个领域。当然那时候也知道端粒酶是依赖于蛋白的：
用蛋白酶消化后的样品也不具备端粒酶活性[8]。1989年，Carol通过跟踪端粒酶活性，用柱子纯化并克隆了四膜
虫的端粒酶RNA亚基。另一个谜底揭开了：RNA亚基有一段RNA序列正好和四膜虫的端粒DNA序列互补，
端粒酶正是利用RNA亚基的这段序列作为模板重复复制出端粒DNA[11]。

端粒和端粒酶领域的领军人物多数是女士。公平起见，不妨多介绍几位。Virginia Zakian女士的实验室发现端粒区域具有TPE效应
（Telomere Position Effect，端粒位置效应），也就是置入端粒区域的基因会被silenced（沉默），
不表达。我们来看看Daniel Gottschling实验室是如何利用TPE现象来设计实验，筛选出酵母的RNA亚基基因的，
同时也见识一下酵母这个非常强大的遗传学模式生物。

首先把URA和ADE两个基因通过遗传重组的方法置入端粒区域。URA基因使酵母能够自己合成uracil（尿嘧啶），
但是该基因能够将化学物质FOA转化成有毒的物质，从而使酵母不能够在含有FOA的平板上生长；
缺少ADE基因则会让酵母累积红色素，使酵母克隆变成红色。由于端粒的TPE效应，URA和ADE被silenced，
酵母只能在含有uracil的培养基中生长，能在FOA平板上生长，且克隆是红色，。在这个遗传改造过的酵母中转入酵母的
cDNA表达库，可以预计，某些调控端粒长度的基因通过过表达可以改变端粒的长度。如果端粒长度变得足够短的话，
TPE效应就会消失，URA和ADE两个基因就会启动表达。那么这种短端粒的酵母就能够在不含有uracil的培养基中生长，
不能在FOA平板上生长，并且酵母克隆显示出红色。用这三个指标进行筛选，可以筛选到一系列影响端粒长度的基因。
其中一个基因比较特殊，任何阅读框都只能阅读一小段蛋白序列，看起来更象个RNA基因。深入研究发现这个基因
含有酵母端粒序列的互补序列，而且对这一序列进行突变，酵母的端粒序列也发生相应的改变-这个基因
正是编码酵母端粒酶RNA亚基的基因[12]。这个发现有运气的成分，因为一般情况下，端粒酶正调控基因过表达，
端粒应该变长才对。但是恰恰相反，酵母RNA亚基的过表达，端粒反而变得很短。此后的1995年，
同样是Liz实验室报道了酵母端粒酶的活性[13]。

端粒酶催化亚基的发现

到RNA亚基被揭示为止，谜团就只剩下端粒酶的蛋白质亚基了。端粒酶既然能够利用RNA模板亚基来复制DNA，
那么很容易推测这个蛋白亚基可能具有RNA dependent DNA polymerase活性（依赖于RNA的DNA聚合酶活性），
也就是逆转录酶的活性。更进一步地说，它的蛋白序列里应该包含逆转录酶特有的结构域。尽管没有实验证据，
这个谜底已经猜到了一半，很多人都想彻底地揭开它，不同实验室的竞争也变得激烈起来。

1989年，端粒与端粒酶领域的另外一位女杰，Jack Szostak实验室的Vicki Lundblad利用设计精巧的遗传学筛选方法
从酵母中筛选到了EST1基因（这个遗传学方法描述起来比Daniel Gottschling的更为复杂，这里就不多介绍了，
有兴趣的去读原始文献）。敲除EST1基因，端粒会随着酵母的传代逐渐缩短，最后缩短到一定程度的时候，
酵母就衰老死亡[14]。

Est1蛋白从酵母的表型看来很像是端粒酶的蛋白催化亚基。Vicki Lundbrad和Liz在90年的Cell杂志上大胆猜测
Est1蛋白含有逆转录酶的结构域[15]。Virginia Zakian实验室在95年的cell上也报道Est1蛋白是酵母端粒酶的体外
活性所必需的[16]。不过发表在顶尖杂志的工作并不一定是好工作，科学也有谬误的时候，尤其是在竞争激烈，
人们已经感觉得接近于揭开谜底的时候容易急躁，匆忙发表了一些不够solid（可靠）的数据。
这一次运气不站在她们一边，谜底猜错了。

那么端粒酶的催化亚基是什么呢？1996年，Tom Cech实验室用生化的手段纯化了四膜虫端粒酶复合体，
其中有一个蛋白根据分子量命名为p123 [17]。同一时期，Vicki Lundblad实验室改进了她的遗传学筛选方法，
筛选到了几个与酵母端粒复制密切相关的基因，命名为EST2，EST3和EST4（也叫CDC13）[18]。
这个改进版的筛选方法非常厉害，它把酵母端粒酶全酶的亚基一网打尽。值得一提的是尽管这个结果
只发表在“影响因子”不太高的Genetics（遗传学）上，它的影响却非常深远，此后很长一段时间乃至到现在，
酵母端粒和端粒酶的研究都集中在阐述这几个基因的功能上。

用生化方法纯化出来的四膜虫p123蛋白，以及用遗传学方法筛选出来的酵母Est2蛋白后来都被Tom Cech
实验室证明是端粒酶的催化亚基：它们含有逆转录酶的结构域，如果对该结构域的关键氨基酸进行突变，
则端粒酶活性消失[19]。同年的1997年稍晚于 Tom Cech，第一个发现癌基因RAS的Robert Weinberg
也参与了这个工作，他们也报道了酵母和人的端粒酶催化亚基[20, 21]。此后，人们用体外转录和翻译系统共
表达了端粒酶的催化亚基和RNA亚基，在体外重建了端粒酶活性，证明这两个核心亚基是端粒酶活性的必需且
完备条件（sufficiency）[22]。

至此，有关染色体末端隐缩问题和保护问题的谜底终于全部揭开了。端粒与端粒酶的一系列发现完美地
解释了这两个问题：染色体末端的DNA由简单重复的端粒序列构成，端粒（本文为了简洁称端粒DNA为端粒，
其实端粒的准确定义是端粒DNA和结合蛋白形成的复合体）保护着染色体末端，使之区别于一般的断裂染色体末端，
而不被各种酶降解，相互之间不能融合。端粒酶负责端粒的复制，端粒酶的催化亚基利用端粒酶自己的RNA亚基
作为模板来不断重复复制出端粒DNA，从而补偿在染色体复制过程中的末端隐缩，保证染色体的完全复制。

这的确是非常完美的发现旅程。然而生物体在展示内在的简单性的同时，还会显示出它内在的多样性和复杂性。
需要指出的是本文描述的只是端粒和端粒酶领域发现的主线。实际上，细胞穿过亿万年的时光，
在漫长的进化过程中尝试了各种可能性。端粒酶复制只是其中一种最为普遍的解决染色体末端隐缩问题的方式。
回到最初的猜想，当时人们猜测同源重组延伸端粒的假说也并没有错，细胞实际上也可以通过同源重组的
方式延伸端粒[23]。裂殖酵母可以通过染色体头尾相联，环化的方式来避开染色体末端隐缩的问题，
在缺乏端粒的情况下生存传代[24]。这与James Watson提出的染色体联体的猜想颇有异曲同工之妙。
果蝇能通过转座子的不断复制延伸端粒[25]。而病毒更是无所不用其极，它们能够利用蛋白[26]
或者tRNA[27]作为引物来起始基因组DNA的合成，从而使自己的染色体解决复制的隐缩问题。

不得不赞叹，进化，或者生物体，真是天才啊！

Time will tell（时间将告诉一切）-端粒和端粒酶发现历程的启示

从本文的描述可以看出，端粒和端粒酶最重要的发现都是在四膜虫或者酿酒酵母这两个低等的模式生物上获得的。
一些低等生物，比如酿酒酵母在遗传学操作上的相对优势，由于技术上的发展，尤其是RNAi技术
在哺乳动物细胞上的应用，已经慢慢变小。但是这个案例仍然说明，模式生物在某种意义上没有优劣之分，
重要的是想解决的问题是什么，然后选择最可能回答问题的模式生物作为材料。

随着越来越明显的竞争，现在中国的科学界里充满着浮躁的气息。很多导师整天催逼着学生工作，
快速地发文章，申请基金，而忘了科研人员需要静下心来阅读文献和缜密思考，找出问题的关键，
并对课题进行精心讨论和设计。学生在这种环境下承担着繁重的实验任务，也不能充分体验到追逐科学问题的乐趣，
逐渐散失了科研的主动性。本文提供了一个很好的科学问题推演的案例。它表明，有思想的，
原创性的成果才能真正为科学做出贡献，并最后胜出。

不得不说，这种浮躁的气息与科研基金的导向也密切相关。现在的项目资助都要求科研与重大疾病、
国计民生挂钩。的确，公众纳税人有投入就要产出的要求，而科学界的研究模式也逐渐地从
以纯好奇为动力的研究演化成以社会需求为动力的研究。但是这一切都要以尊重科学自身的发展规律为前提。

科学发现的历史一再重复着一个事实，许多伟大的发现来自于对科学基本问题的追寻，而这些重要问题的
解决必然会有在当时不能估量的应用前景。譬如端粒的发现使人工染色体得以发明，人工染色体的发明后来
又为基因组测序做出重要贡献。其次基于已有知识的应用研究固然值得大力支持，但是首先是当前对生命基本活动
的了解还很有限，一味地往应用研究导向效果不会很明显。中国作为一个大国，以社会需求为动力的应用研究，
和以解决在科学发展中出现的基本问题为动力的基础研究，应该并驾齐驱，相得益彰。

最后以Liz和Carol在2004年回忆她们发现的一段话作为结尾。“Time will tell which connections 
between telomerase and health will endure... We did not set out to find a new approach to cancer therapy 
or studyspecific disease mechanisms. We were simply interested in how chromosomes are maintained...
Yet the history of medicine is filled with examples of advances from improbable places。”（时间将告诉人们
端粒酶和人类健康的何种联系才能持久下去……我们最初并不是着手于想要找到一个新的治疗癌症的方法
或者研究某个疾病的机理……但是医学的历史充满了从不可能的地方获得重大进展的例子。）[10]

附：本文提到的端粒和端粒酶发现大事记

1939年，Barbara McClintock发现玉米细胞的染色体断裂末端容易融合
1972年，James Watson提出染色体复制的末端隐缩问题
1978年，报道四膜虫的端粒序列
1982年，端粒的发现导致人工染色体的发明
1984年，报道酵母的端粒序列
1985年，报道四膜虫的端粒酶活性
1989年，报道四膜虫端粒酶的RNA亚基
1994年，报道酵母端粒酶的RNA亚基
1995年，报道酵母端粒酶活性
1996年，纯化了四膜虫端粒酶的催化亚基遗传筛选到酵母端粒酶的催化亚基
1997年，证明了四膜虫和酵母端粒酶的催化亚基

 参考文献 (略)